Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy

Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

VYŠETŘOVACÍ METODY V IMUNOLOGII

2., přepracované a doplněné vydání

Editoři: Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.

RNDr. Milan Paulík, CSc.

Autorský kolektiv: Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

Doc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

RNDr. Milan Paulík, CSc., FN Thomayerova, Praha

Prof. MUDr. Karel Smetana, DrSc., Anatomický ústav UK 1. LF UK, Praha

Prof. MUDr. Anna Šedivá, DSc., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

Doc. MUDr. Radek Špíšek, Ph.D., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

Ing. Luděk Šprongl, Nemocnice Šumperk

MUDr. Eva Vernerová, Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

Technická spolupráce: Mgr. Štěpán Peterka

Recenze: Prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.

Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc., MBA

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2011

Obrázky dodali autoři.

Obrázek 12 podle předlohy autorů překreslila Jana Řeháková, DiS.

Cover Photo © fotobanka allphoto, 2011

Vydala Grada Publishing, a.s.

U Průhonu 22, Praha 7

jako svou 4510. publikaci

Odpovědná redaktorka Šarlota Pokorná

Sazba a zlom Šarlota Pokorná

Počet stran 168 + 4 strany barevné přílohy

2. vydání, Praha 2011

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-3533-7

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-7089-5 pro formát PDF

ISBN 978-80-247-7090-1 pro formát EPUB

Seznam zkratek

ACA anticentromerové autoprotilátky

ACLA antikardiolipinové autoprotilátky (anticardiolipin autoantibodies)

ADCC buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)

AIDS syndrom získané imunodeficience (acquired immune deficiency syndrome)

ALPS autoimunitní lymfoproliferativní syndrom

ANA antinukleární autoprotilátky (antinuclear autoantibodies)

ANCA antineutrofilní cytoplazmatické protilátky (antineutrophil cytoplasmic anti-bodies)

APC buňka předkládající antigen (antigen-presenting cell)

aPTT aktivovaný parciální tromboplastinový čas

ASMA protilátky proti hladkému svalu (anti-smooth muscle autoantibodies)

BAT test aktivace bazofilů (basophile activation test)

BCG Calmetteův-Guérinův bacil

BCR receptor lymfocytů B (B cell receptor)

BPI protein zvyšující baktericidii a permeabilitu (bactericidal permeability increasing protein)

C1 INH inhibitor C1 složky komplementu

CAST test degranulace bazofilů

CD diferenciační antigen (cluster designation)

cDNA komplementární kyselina deoxyribonukleová (complementary DNA)

CDR oblast determinující komplementaritu (complementary determining region)

CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester

CGD chronická granulomatózní choroba (chronic granulomatous diseases)

CID kombinovaný imunodeficit (combined immunodeficiency)

CL chemiluminiscence

CMV cytomegalovirus

CNS centrální nervový systém

CRP C-reaktivní protein (C-reactive protein)

CTL cytotoxický lymfocyt T (cytotoxic T lymphocyte)

CVID běžný variabilní imunodeficit (common variable immunodeficiency)

DBPCT dvojitě slepý placebem kontrolovaný pokus (double blind placebo controled test)

DC dendritická buňka (dendritic cell)

DNA deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

dsDNA dvoušroubovice DNA (double stranded DNA)

DTH reakce pozdní přecitlivělosti (delayed hypersensitivity test)

EA časný antigen (early antigen)

EBNA nukleární antigen viru Epsteina-Barrové (EB nuclear antigen)

EBV virus Epsteina-Barrové (Epstein-Barr virus)

ECP eozinofilní kationický protein (eosinophil cationic protein)

EDTA kyselina dietylen tetraoctová

EHK externí hodnocení kvality

EIA enzymová imunoanalýza

ELISA enzymová imunoanalýza na imunosorbentech (enzyme-linked immunosorbent assay)

ENA extrahovatelné nukleární antigeny

FISH fluorescenční in situ hybridizace (fluorescent in situ hybridization)

FITC fluorescein izothyocyanát

FSc parametr analýzy u průtokové cytometrie (forward scatter)

GAD dekarboxyláza kyseliny glutamové (glutamic acid decarboxylase)

GAPDH glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza

G-CSF faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyte colony stimulating factor)

HBV virus hepatitidy B

HCV virus hepatitidy C

HIV virus lidské imunodeficience (human immune deficiency virus)

HLA hlavní komplex lidských histokompatibilních antigenů (human leukocyte antigen complex)

HLH hemofagocytující lymfohistiocytóza

CH100 celková hemolytická aktivita komplementu (100%)

CH50 celková hemolytická aktivita komplementu (50%)

IFN interferon

IgA imunoglobulin A

IgD imunoglobulin D

IgE imunoglobulin E

IgG imunoglobulin G

IgM imunoglobulin M

IL interleukin

INT jod-nitroblue tetrazolium

JCA juvenilní chronická artritida

LAD syndrom defektní adhezivity leukocytů (leukocyte adhesion deficiency syndrome)

LFA adhezivní molekula ze skupiny integrinů (leukocyte-function-associated antigen)

LKM protilátky proti mikrozomům jater a ledvin (liver-kidney microsomes antibodies)

MAC komplex složek komplementu atakující membránu a vyvolávající lýzu (membrane attack complex)

MALT slizniční imunitní systém (mucosa associated lymphoid tissue)

MBL lektin vázající manózu (mannose binding lectin)

MCTD smíšená choroba pojiva (mixed connective tissue disease)

MGUS monoklonální gamapatie nejasného významu (monoclonal gammapathy of un-known significance)

MHC molekuly tkáňové slučitelnosti (major histocompatibility complex), viz HLA

MPO myeloperoxidáza

MSHP mikrosférické hydrofilní partikule

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (nicotinamid adenin dinucleotide phosphate)

NBT nitrotetrazoliová modř (nitroblue tetrazolium chlorid)

NK přirozený zabíječ (natural killer)

OPD ortofenylendiamin

PAA polyakrylamid

PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza

PBMC mononukleární buňky z periferní krve (peripheral blood mononuclear cells)

PCR řetězová polymerázová reakce (polymerase-chain reaction)

PE fykoerytrin

PEG polyetylenglykol

PHA fytohemaglutinin (phytohemaglutinin)

PI propidium jodid

PMA forbol myristát acetát (phorbol myristate acetate)

PMN polymorfonukleární leukocyty (polymorphonuclear cell)

PWM poke weed mitogen

RA revmatoidní artritida

RAST radioallergosorbent test

RF revmatoidní faktory

RIA radioimmunosorbent-assay

RISA ring-immunosorbent assay

RNA kyselina ribonukleová (ribonucleic acid)

RPMI médium

RT-PCR reverzně transkriptázová polymerázová řetězová reakce (reverse transcriptase polymerase chain reaction)

SCID těžký kombinovaný imunodeficit (severe combined immunodeficiency)

SI stimulační index

SLE systémový lupus erythematodes (systemic lupus erythematodes)

SSc parametr analýzy u průtokové cytometrie (side scatter)

SSP sekvenčně specifické primery

Tc cytotoxický lymfocyt T pro antigen (cytotoxic T cell)

TCR receptor lymfocytu T (T cell receptor)

TdT terminální deoxyribonukleotid transferáza

TGF transformující růstový faktor (transforming growth factor)

Th pomocný lymfocyt T (helper T cell)

TMB tetrametylbenzidin

TNF faktor nekrotizující nádory (tumor necrosis factor)

Tr regulační lymfocyt T (regulatory T cell)

TSH hormon stimulující tyroideu (thyreoid stimulating hormon)

VCA virový kapsidový antigen (viral capsid antigen)

VCAM vaskulární adhezivní molekula (vascular cell adhesion molecule)

Úvod

Uplynulo již dvacet let od doby, kdy se čtenářům dostala do rukou skvělá kniha Vybrané diagnostické metody v imunologii autorů J. Procházkové a C. Johna. Dodnes je tato pub-likace součástí knihovničky imunologických laboratoří. Pokud se nějaký student, ať již v pregraduálním, nebo postgraduálním studiu, chtěl něco dozvědět o základních imunologických technikách, sáhl po této knize. Doba však již pokročila a řada metod se změnila, některé zanikly, jiné přibyly. Studenti medicíny i přírodních věd, postgraduální studenti v biomedicíně, lékaři stážující v laboratoři před atestací z alergologie a klinické imunologie začali postrádat ucelenou stručnou publikaci, kde by se něco dozvěděli nejen o principech moderních metod, ale také o indikacích k vyšetření a interpretaci výsledků. Posledním impulzem k sepsání této příručky pak byla akreditace bakalářského studia v oboru Zdravotní laborant na 2. lékařské fakultě UK v Praze, a tedy potřeba moderních učebních textů pro tento specifický obor. Kolektiv interních a externích učitelů 2. lékařské fakulty UK se proto rozhodl zaplnit chybějící mezeru na trhu a přichází s touto publikací.

Kniha je koncipována jako praktická přehledná příručka pro klinické i laboratorní pracovníky zabývající se imunologií. V první kapitole je jako výchozí informace pro další texty stručně rekapitulována fyziologie a patologie imunitního systému. Druhá kapitola pojednává o metodikách, které se používají pro diagnostiku imunitních parametrů. Metodiky neobsahují podrobný pracovní protokol, spíše se orientují na principy metod, jejich úskalí, limity, uplatnění v diagnostice různých parametrů imunity. U jednotlivých metod je také zmíněno, jaké přístrojové vybavení metoda vyžaduje a jak je ekonomicky náročná.

Třetí kapitola se zabývá možnostmi stanovení jednotlivých parametrů imunity. Zatímco ve druhé kapitole jsou zmíněny metody (např. nefelometrie), třetí kapitola se zabývá tím, jakými metodami lze stanovit jednotlivé parametry imunity (např. imunoglobuliny– nefelometrií, radiální imunodifuzí …), jaké jsou výhody a nevýhody jednotlivých metod stanovení. Zároveň obsahuje odstavce o fyziologických hodnotách jednotlivých parametrů, popřípadě o specifitě nebo senzitivitě jednotlivých vyšetření a interpretaci patologických výsledků.

Čtvrtá kapitola obsahuje základní algoritmy vyšetření, která jsou indikována u jednotlivých druhů imunopatologických stavů – imunodeficiencí, autoimunitních a alergických chorob. Stručně jsou zmíněny i anamnestické a klinické aspekty, více pozornosti je věnováno laboratornímu spektru. Je zařazena i kapitola o možnostech monitorování protinádorové imunity, neboť předpokládáme, že imunoterapie se v blízké budoucnosti přenese z vědeckého experimentu do klinické praxe a požadavky na imunologické laboratoře se v tomto směru zvýší.

Poslední kapitola je věnována problematice akreditace, certifikace a standardizace v klinických laboratořích.

Oproti starší publikaci Procházkové a Johna neobsahuje kniha podrobné laboratorní protokoly. Doba se změnila a celá řada testů je dodávána výrobci v kompletech, setech nebo je zcela automatizována. Učebnice by byla v tomto aspektu nerovnoměrná: byly by podrobně popsány metody na vyšetření funkcí buněčných složek imunity, které jsou stále založeny na manuálním zpracování, zatímco u většiny testů humorální imunity by bylo napsáno – „zkumavku s krví dáme do analyzátoru a počkáme na výsledek“ nebo „postupujeme dle návodu výrobce“.

Doufáme, že publikaci shledají jako užitečnou lékaři a přírodovědci vzdělávající se v problematice klinické a laboratorní imunologie, postgraduální studenti v biomedicíně přicházející do styku s laboratorními metodami, posluchači bakalářského studia a vyššího odborného studia oboru zdravotní laborant, ale i biochemici, mikrobiologové, farmakologové a také kliničtí lékaři jiných odborností.

Předmluva k 2. vydání

Na začátku školního roku 2009/2010 jsme si uvědomili při úvodní přednášce pro bakalářský obor zdravotní laborant, že při doporučování studijní literatury slovy: „Používejte naši novou učebnici Laboratorní vyšetřovací metody v imunologii,“ mluvíme o knize s rokem vydání 2005. Což znamená, že doporučujeme učebnici starou pět let. Rozhodli jsme se, že pro další školní rok učebnici inovujeme.

Ponechali jsme obdobnou strukturu jako v předešlém vydání, neboť jsme měli na tuto koncepci velmi pozitivní ohlasy. V nové učebnici jsme se snažili zachytit obraz počátku 21. století v imunologických laboratořích. Rozvoj laboratorních technik jde jako rozvoj všech technologií v lidské činnosti nezadržitelně kupředu, ale i v době špičkových technologií zůstávají některé metody „zlatým a prověřeným standardem“ a leckdy se jen obtížně nahrazují moderními technikami. Výpovědní hodnota některých nových technologií pro klinickou diagnostiku není v zásadě o moc přínosnější, než je tomu u metod klasických, přičemž finanční náročnost je někdy enormní. Zmínili jsme metody, které přinejmenším v principu ještě dlouho nezastarají (reakce založené na vazbě antigen–protilátka se po-užívají již více než 80 let). Doplnili jsme metody, které nyní nejsou zcela rutinní, ale již se „o nich ví“, a můžeme očekávat, že si zanedlouho najdou své místo v laboratorní diagnostice, a které již v současnosti tvoří arzenál výzkumných laboratoří. Přestože je naše učebnice zaměřena zejména na laboratorní techniky a jejich význam, snažili jsme se, byť jen ve stručnosti, zmínit, že laboratorní vyšetření není samospasitelné a že ani v éře biočipů, mikroarraí a průtokové cytometrie neztratí v diagnostice imunopatologického stavu svůj význam anamnéza, fyzikální vyšetření a další pomocné vyšetřovací metody.

Za kolektiv autorů editoři

1 Stručná fyziologie a patologie imunitního systému

Jiřina Bartůňková

1.1 Složky a funkce imunitního systému

Imunitní systém patří spolu s endokrinním a nervovým systémem k regulačním mechanizmům organizmu, které zajišťují jeho celistvost a udržování vnitřního prostředí (homeostázu). Základní vlastností imunitního systému je schopnost rozpoznat škodlivé od neškodného, cizí od vlastního. Škodliviny zevního i vnitřního původu jsou likvidovány, neškodné je tolerováno. Unikátní vlastností imunity, obdobnou nervové soustavě, je schopnost učení a paměti. Funkce imunitního systému zajišťuje vzájemná provázanost mechanizmů imunity přirozené – nespecifické a adaptivní – specifické. Do nespecifické imunity patří polymorfonukleární leukocyty, monocyty, makrofágy a dendritické buňky a různé součásti plazmy, jako je komplement a proteiny akutní fáze. Do specifické imunity patří lymfocyty T a lymfocyty B, které se po diferenciaci do plazmatických buněk stávají producenty protilátek.

Látka, která je schopna vyvolat imunitní reakci, se nazývá antigen. Z chemického hlediska jsou antigeny většinou bílkoviny (proteiny) nebo bílkoviny spolu s cukernými složkami – glykoproteiny. Mohou však být i povahy tukové (lipidy, fosfolipidy, glykolipidy) a cukerné (polysacharidy). Pokud je antigen zevního původu, označuje se jako exoantigen. Jedná se nejčastěji o složky mikroorganizmů. Jako alergen se označuje exoantigen, který je schopen u vnímavého jedince navodit nepřiměřenou imunologickou reakci – alergickou reakci. Alergeny mohou být pyly, zvířecí srst, potraviny, léky a další látky. Struktury vlastních tkání, proti nimž se vyvíjí imunitní reakce, se nazývají autoantigeny. Malé molekuly, které jsou schopny vyvolat imunitní reakci pouze po vazbě na makromolekulární nosič (např. albumin), jsou nazývány hapteny (např. léky). Malá oblast molekuly antigenu, která je rozeznávána antigenně specifickými receptory, se nazývá epitop.

Laboratorní imunologické metody jsou v převážné většině založeny na reakci antigen–protilátka (kapitola 2). Antigenem v těchto reakcích může být jakákoliv složka, která je vyšetřována, tj. i protilátka (např. lidský imunoglobulin). Protilátkou je pak v systému zvířecí imunoglobulin, který byl vyroben imunizací zvířete zkoumanou lidskou protilátkou, neboť ta coby cizorodá bílkovina představuje pro zvířecí imunitní systém antigen.

Buňky imunitního systému spolu s pojivovými buňkami a dalšími strukturami tvoří anatomické a funkční celky – lymfatické orgány a tkáně. Buňky zajišťující imunitní reakce se nazývají imunokompetentními buňkami. Centrálními lymfatickými orgány jsou kostní dřeň a brzlík (tymus). Jsou to místa, kde dochází ke vzniku, diferenciaci a zrání imunokompetentních buněk. V kostní dřeni vznikají všechny imunitní buňky ze společné kmenové buňky. Ta se dále diferencuje na myeloidní a lymfoidní buněčné linie. Z myeloidní linie vznikají červené krvinky a krevní destičky a dva druhy bílých krvinek, granulocyty a monocyty. Z lymfoidní linie vzniká další druh bílých krvinek – lymfocyty. Ty, které se dále vyvíjejí v tymu, se označují jako lymfocyty T. V kostní dřeni se vyvíjí celá linie myeloidní a lymfocyty typu B, z nichž se posléze stávají buňky plazmatické, které produkují protilátky. Mezi imunokompetentní buňky se řadí také buňky dendritické, jejichž hlavní funkcí je pohltit a zpracovat antigen, vystavit jej na svém povrchu a přilákat příslušné lymfocyty T a B, které pak rozvinou imunitní reakci.

Periferní (sekundární) lymfatické orgány a tkáně jsou místem, kde probíhá imunitní reakce a kde se diferencují lymfocyty T a B do výkonných populací. Patří sem slezina, lymfatické uzliny a lymfatická tkáň asociovaná se sliznicemi (MALT – mucous associated lymphoid tissue). Anatomická struktura periferních lymfatických orgánů umožňuje optimální spolupráci lymfocytů T a B s buňkami prezentujícími antigen. Dochází k jejich aktivaci, růstu, diferenciaci a konečnému vzniku výkonných lymfocytů. Lymfatické orgány a tkáně jsou propojeny sítí lymfatických a krevních cév. Nově vzniklé lymfocyty se dostávají z centrálních do periferních lymfatických orgánů krevním řečištěm, odkud přestupují cévní stěnou. Sekundární lymfatický orgán opouštějí lymfatickými cévami, jimiž se dostávají cirkulací do tkání.

Pro imunitní reakce jsou důležité interakce imunokompetentních buněk s dalšími buňkami, které nepocházejí z hematopoetických (krvetvorných) kmenových buněk. Patří sem například folikulární dendritické buňky, endotelie (výstelka cév), buňky nervového systému, epiteliální buňky sliznic a fibroblasty.

Funkce imunitního systému vykonávají jednak některé součásti krevního séra, nazývané humorální faktory, a jednak krevní buňky. Buňky kolují v krevním a mízním oběhu a v případě potřeby vycestují do místa, kde je jich potřeba. Některé buňky imunitního systému jsou usazeny v tkáních a necestují. Podle toho, zda se v imunitní reakci více uplatní humorální faktory nebo buňky, se složky imunity rozdělují na humorální a buněčné. Podle toho, jakým způsobem imunitní složky rozpoznávají antigen, dělíme imunitní systém na složky specifické (adaptivní) a nespecifické (přirozené). Všechny složky imunity spolu úzce spolupracují a navzájem se ovlivňují a regulují buď přímým kontaktem zprostředkovaným adhezními molekulami na buněčném povrchu, nebo rozpustnými mediátory, zejména cytokiny. Základní charakteristiky buněčné a humorální imunity uvádí tabulka 1.

Tab. 1 Srovnání humorální a buněčné imunity

humorální

buněčná

nespecifické složky

proteiny akutní fáze, komplement

buňky NK, neutrofilní leukocyty, monocyty, makrofágy

specifické složky

protilátky

lymfocyty T

hlavní funkce

obrana proti extracelulárně žijícím mikroorganizmům (opsonizace)

obrana proti intracelulárně žijícím mikroorganizmům, u neutrofilů i obrana proti extracelulárním mikroorganizmům, zánětlivá reakce

materiál na vyšetření

sérum, plazma, ev. jiné tekutiny (sliny, mozkomíšní mok)

nesrážlivá krev, bioptické vzorky tkání, ev. jiné zdroje (mozkomíšní mok, bronchoalveolární laváž)

1.2 Buněčné složky imunity

Do buněčné imunity nespecifické patří fagocytující buňky (polymorfonukleáry a monocyty/makrofágy) a buňky NK (tzv. přirození zabíječi – z anglického natural killer cells). Specifickou složku tvoří lymfocyty T. Po aktivaci produkují tyto buňky rozpustné mediátory, zvané cytokiny. Ty aktivují další složky imunity nebo samy sebe a stávají se z nich buňky regulační nebo zabíječské (cytotoxické).

Buněčná imunita se uplatňuje v obraně organizmu proti virovým, plísňovým a některým bakteriálním infekcím (způsobeným nitrobuněčnými parazity, např. mykobakteriemi) a v obraně proti nádorům (zejména vyvolanými onkogenními viry). V transplantační medicíně se buněčné složky podílejí na odvržení transplantované tkáně. Složky buněčné imunity se vyšetřují z nesrážlivé krve.

1.2.1 Buněčná imunita nespecifická

1.2.1.1 Fagocytující buňky

Fagocytující buňky jsou buď monocyty/makrofágy, nebo polymorfonukleární leukocyty. Jsou nadány schopností fagocytózy, která zahrnuje putování za škodlivinou (chemotaxi), její rozpoznání, pohlcení, zpracování, usmrcení a sekreci látek, které působí na ostatní systémy imunity a další tkáně organizmu. Na membráně fagocytů jsou adhezní molekuly, které zajišťují přilnutí k endotelu cévní stěny. Rozpoznání cizorodé částice se děje prostřednictvím receptorů, které se váží přímo na struktury sdílené různými mikroorganizmy (např. Toll-like receptory, lektinové receptory), nebo nepřímo prostřednictvím protilátky nebo komplementu (receptor pro Fc-část protilátky, komplementové receptory).

Po pohlcení mikroorganizmu (nebo po aktivaci jinými podněty) se aktivuje systém enzymů, který zpracovává kyslíkovou molekulu na metabolity s baktericidním (bakterie zabíjejícím) účinkem. Baktericidní účinek mají i některé součásti cytoplazmatických granul s enzymatickou aktivitou (kationické proteiny, defenziny). Granula obsahují i další proteo-lytické enzymy, které se účastní trávení pohlceného mikroorganizmu. Při rozsáhlém zánětu se mohou kyslíkové radikály a enzymy z granulí dostat vně buňky a poškozovat okolní tkáně. Při zánětlivé reakci uvolňují fagocyty mediátory zánětu – produkty metabolizmu kyseliny arachidonové, tj. prostaglandiny, leukotrieny a tromboxany. Tyto látky spolu s cytokiny stimulují specifické složky imunity a zpětně regulují rozsah zánětlivé reakce.

Výše zmíněné vlastnosti mají jak systém monocytomakrofágový, tak polymorfonukleární leukocyty. V některých funkcích se liší: monocytomakrofágový systém je tvořen monocyty kolujícími v krevním oběhu a z nich se diferencují tkáňové makrofágy. Monocyty se diferencují také v dendritických buňkách. V různých tkáních se buňky odvozené z monocytů nazývají různými jmény: Langerhansovy buňky v kůži, Kupfferovy buňky v játrech, alveolární makrofágy v plicích, peritoneální makrofágy v dutině břišní, oligodendroglie v centrálním nervovém systému aj. Systém monocytomakrofágový má hlavní význam při zpracování a předkládání antigenů lymfocytům. To je jedním z kroků k vyvolání specifické imunitní reakce. Při aktivaci monocytů se produkují různé cytokiny, které aktivují specifické složky imunity a zároveň zprostředkují celkovou reakci organizmu na přítomnost škodliviny, např. zvýšení teploty, produkci proteinů akutní fáze. Toto je účinek zejména interleukinu 1 a 6 (IL-1, 6) a faktoru nekrotizujícího nádory (TNF). Lymfocyty T aktivované cytokiny (zejména interleukinem 12) pak zpětně produkcí interferonu gama aktivují makrofágy, které jsou pak schopny ničit pohlcené nitrobuněčné mikroby, jako např. mykobakteria, toxoplazmy aj. Aktivace makrofágu spočívá zejména v indukci syntázy oxidu dusnatého za vzniku tohoto baktericidního oxidu dusnatého.

Polymorfonukleární leukocyty cirkulují v krevním oběhu, odkud mohou vycestovat. Mají krátký poločas života, kolem 12 hodin. U normálního jedince jich je v krvi přibližně 2–8 x 109/l. Fagocytózou jsou nadány neutrofilní a eozinofilní granulocyty. Neutrofilní granulocyty tvoří asi 40–60 % všech leukocytů, eozinofily asi 3 %. Neutrofilní granulocyty se uplatňují jako obránci první linie proti extracelulárním mikrobům, hlavně stafylokokům, kolibakteriím, pseudomonádám, ale i některým plísním (např. kandidám, aspergilům). Svými produkty aktivují další imunokompetentní buňky, podobně jako monocyty produkují zánětlivé cytokiny IL-1, IL-6 aj., které způsobí zvýšení teploty. Eozinofilní granulocyty se uplatňují zejména v obraně proti mnohobuněčným červům (parazitům) a při alergických reakcích.

1.2.1.2 Buňky NK

Buňky NK (přirození zabíječi) jsou lymfocyty, které nejsou ani T, ani B. Mají hrubá granula v cytoplazmě. Patří do systému nespecifické imunity. Podílejí se na zabíjení buněk infikovaných viry nebo nádorově změněných. Buňky NK rozeznávají cílové buňky, které neexprimují vlastní tkáňové molekuly slučitelnosti (tzv. MHC/HLA molekuly, viz dále). Pro tyto molekuly mají buňky NK receptory, které inhibují buněčné funkce. To znamená, že po rozpoznání buňky, která na svém povrchu nese HLA, se buňka NK neaktivuje. Pokud není HLA na cílové buňce přítomno, převáží stimulační receptory (např. Fc-receptory, lektinové receptory aj.) a dojde k aktivaci buněk NK. Z cytoplazmy se uvolní granula obsahující perforiny, kterými ničí cílovou buňku tím, že ji „proděraví“ a navíc umožní průnik enzymů kaspás, které navodí v cílové buňce apoptózu. Charakteristickým znakem buněk NK jsou molekuly CD16 (receptor pro Fc-část protilátky pro IgG) a CD56.

1.2.1.3 Bazofily, žírné buňky a další buňky

V imunitní a zánětlivé reakci hrají důležitou úlohu také bazofilní leukocyty a žírné buňky. Bazofily cirkulují v krevním řečišti, obdobné žírné buňky sídlí převážně v podslizniční tkáni. Pro bazofily a žírné buňky jsou typická granula, která obsahují histamin, serotonin, kininy a po aktivaci secernují produkty kyseliny arachidonové, leukotrieny, prostaglandiny a další látky. Mají na svém povrchu navázané molekuly imunoglobulinu E, na které se může vázat antigen (alergen), tím dojde k degranulaci a uvolnění látek z granulí, které působí projevy alergických reakcí.

Imunitních reakcí se účastní i buňky, které přímo nepatří do složek imunitního systému. Příkladem jsou erytrocyty (podílejí se na vychytávání komplexů antigenu a protilátky) a trombocyty (účastní se zánětlivých a alergických reakcí). Také fibroblasty, endotelie a epitelie produkují některé cytokiny a exprimují po aktivaci adhezní molekuly, které usnadňují průnik bílých krvinek do tkání.

1.2.2 Buněčná imunita specifická

Představiteli specifické buněčné imunity jsou lymfocyty T. Lymfocyty se vyvíjejí z lym-foidních předchůdců z kostní dřeně a dozrávají v tymu (brzlíku). Dělí se podle funkcí na několik podskupin. Je možné je rozlišit pomocí membránových znaků (receptorů) označovaných jako CD. Pro všechny lymfocyty T jsou charakteristické znaky CD2 a CD3. Molekula CD3 je součástí receptoru pro antigen, tzv. TCR. Tento receptor váže antigen nabídnutý buňkou prezentující antigen ve spojení s molekulami systému HLA, zatímco molekuly CD2 a CD3 fungují jako adhezní a signalizační molekuly.

1.2.2.1 Lymfocyty T – pomahači

Podskupina lymfocytů T má na povrchu receptor označovaný CD4 a má zejména funkci tzv. pomahačů, helperů. Lymfocyty CD4+ rozpoznávají antigen, který jim předkládá buňka prezentující antigen spolu s molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (HLA) II. třídy (viz dále), pro které je molekula CD4 receptorem. Tyto lymfocyty se po styku s antigenem pod vlivem různých faktorů (nespecifických i specifických složek imunity a jejich produktů) diferencují do funkčních podtypů označovaných Th1, Th2, Th3, Th17 a Treg. Tyto podskupiny se liší produkcí různého spektra cytokinů: pro Th1 je charakteristická produkce interferonu gama, pro Th2 interleukinů 4 a 5, Th17 produkují interleu-kin 17. Th1 indukují imunitní reakci buněčného typu, Th2 převážně humorálního typu. Th3 a Treg produkcí zejména cytokinů IL-10 a TGF-beta (transformující růstový faktor beta) regulují rozsah imunitní reakce a mají spíš tlumivý vliv na její rozvoj.

Receptor CD4 je zároveň receptorem pro virus HIV, který je původcem syndromu získané imunodeficience – AIDS, selhání imunity je zde dáno především poruchou funkce těchto lymfocytů, což se odrazí ve funkci celého imunitního systému.

1.2.2.2 Lymfocyty T – supresorově cytotoxické buňky

Druhá hlavní podskupina lymfocytů T má znak CD8. Tato subpopulace vykonává funkci cytotoxickou a supresorovou (tj. ničí infikované nebo nádorové buňky a potlačuje, reguluje imunitní reakci). Lymfocyty CD8+ rozpoznávají antigen spolu s molekulami hlavního histokompatibilního komplexu I. třídy (HLA I. třídy). Stejně jako u předchozí skupiny je receptorem pro antigen komplex TCR a molekula CD8 je receptorem pro část molekuly HLA I. třídy. Podobně jako CD4+ lymfocyty se i tyto dělí do funkčních podskupin charakterizovaných produkcí rozličných cytokinů.

1.2.2.3 Paměťové buňky

Po prvním setkání antigenu s imunitními mechanizmy zůstávají v organizmu paměťové buňky, které při opakovaném setkání s ním zajistí rychlejší a účinnější imunitní odpověď. Za paměťové buňky jsou považovány lymfocyty T, nesoucí mj. znak CD45RO. Lymfocy-ty B s funkcí paměťových buněk mají znaky CD19 a CD62L.

Tab. 2 Základní typy lymfocytů

hlavní

membránové znaky

hlavní intracelulární znaky nebo produkty

funkce

lymfocyty B

CD19, CD20

cytoplazmatické imunoglobulinové řetězce

diferenciace do plazmatických buněk produkujících protilátky

lymfocyty pomahači – typ Th1

CD3, CD4

IFN-γ

indukce buněčné imunity

lymfocyty pomahači –typ Th2

CD3, CD4

IL-4

indukce humorální imunity (spolupráce s  lymfocyty B při produkci protilátek)

lymfocyty pomahači – typ Th3

CD3, CD4

TGF-β

regulace imunitní reakce, hojení, produkce vaziva, jizvení

lymfocyty pomahači – typ TH17

CD3,CD4

IL-17

aktivace neutrofilů, protibakteriální a protiplísňová aktivita

lymfocyty regulační – Treg

CD4, CD25

IL-10

regulace imunitní reakce, potlačení autoimunitních buněk

lymfocyty

cytotoxické

CD3, CD8

perforiny

cytolýza nádorových buněk nebo buněk infikovaných viry

paměťové buňky

CD3, CD4, CD45RO

imunologická paměť

1.3 Humorální složky imunity

Humorální imunita je zajišťována součástmi plazmy: protilátkami a systémem krevních bílkovin, které se nazývají komplement. Kromě toho je v séru celá řada dalších bílkovin, které se účastní v akutní fázi zánětu, nazývají se proto proteiny akutní fáze. Patří sem například CRP (C-reaktivní protein), MBL – lektin vázající manózu, sérový amyloid A, fibronektin aj.

Humorální imunita se uplatňuje v obraně proti extracelulárně se množícím opouzdřeným bakteriím (pneumokokům, streptokokům, Neisseriím aj.). Složky humorální imunity působí jako opsoniny, tj. látky, které vazbou na mikroba usnadňují jeho pohlcení fagocytujícími buňkami. Protilátky mají schopnost vázat komplement, který se tímto aktivuje a způsobí rozpad mikroorganizmu, na nějž se naváže komplex protilátky a komplementu. Mikroorganizmus může být také zničen cytotoxickým lymfocytem nebo makrofágem. Protilátka zprostředkuje kontakt mezi těmito dvěma buňkami (tzv. reakce ADCC, buněčná cytotoxicita zprostředkovaná protilátkami). Látky toxické povahy mohou být protilátkami neutralizovány (např. očkováním proti tetanickému toxinu se navodí tvorba protilátek, které potom zabrání účinku toxinu produkovaného bakteriemi, jimiž se člověk může infikovat při poranění).

Složky humorální imunity se vyšetřují převážně ze srážlivé krve (ze séra), některé je možné stanovit i v plazmě.

1.3.1 Nespecifické složky humorální

1.3.1.1 Komplementový systém

Komplementem je nazýván systém plazmatických bílkovin produkovaných především jaterními buňkami, z menší části makrofágy. Celkem je devět základních složek komplementu, označovaných C1–C9, a dalších různých proteinů s regulačními funkcemi. Složky komplementu jsou přítomny v séru v neaktivní formě. Aktivují se různým způsobem, tzv. klasická cesta je spuštěna vazbou složky C1 na komplex protilátky s antigenem. Obdobná je lektinová cesta, místo protilátky aktivuje složku C1 sérový lektin vázající manózu (MBL). Třetí cesta, tzv. alternativní, je vyvolána reakcí složky C3, např. s enzymy uvolněnými z poškozených tkání. Aktivace komplementu je kaskádou reakcí (podobnou procesu srážení krve), při kterých se aktivují další složky komplementu. Konečný komplex vazbou na membránu vytvoří póry a způsobí tak rozpad buňky. Na každém stupni aktivace se zároveň spouští regulační pochody, které jsou zajišťovány inhibitory nebo inaktivátory (enzymy nebo vazebnými proteiny). Vlastní buňky organizmu jsou před účinkem komplementu chráněny zvláštními ochrannými molekulami. V průběhu kaskády aktivace komplementu vznikají štěpy jednotlivých součástí (označované písmeny a, b ...). Pro jednotlivé součásti komplementu existují na buňkách komplementové receptory. Funkce komplementu a jeho štěpů uvádí tabulka 3.

Tab. 3 Základní funkce komplementu

funkce

vykonávají složky

opsonizace (tj. vazba na mikroorganizmus, aby byl lépe pohlcen fagocyty)

C3b, C4b

chemotaxe (tj. pohyb buněk do místa zánětu ve směru koncentračního gradientu zánětlivých látek, chemotaxinů)

C3a, C5a, komplex C567

tvorba anafylatoxinů (tj. látek, které vyvolávají anafylaktickou reakci, tj. degranulaci žírných buněk, tvorbu histaminu, způsobují zvýšenou prospustnost cév)

C3a, C5a

zničení cílové buňky

membranolytický komplex C89

1.3.1.2 Proteiny akutní fáze

Důležitou složkou nespecifické imunity jsou tzv. proteiny akutní fáze. Jde o proteiny syntetizované játry v odpověď na aktivaci imunity infekčními i neinfekčními antigeny. Induktorem syntézy proteinů akutní fáze jaterními buňkami jsou prozánětlivé cytokiny, zejména IL-6. Za normálních okolností je koncentrace těchto proteinů nízká nebo i neměřitelná, při zánětu se zvyšují různou měrou. Druhá skupina proteinů se naopak při zánětu snižuje (např. albumin). Hlavním proteinem akutní fáze je C-reaktivní protein, CRP. Strukturálně patří do složitých molekul pentraxinů. Jeho fyziologickou funkcí je vazba na fragmenty DNA, která se při zánětu uvolňuje z poškozených buněk. Dalšími proteiny akutní fáze jsou složky komplementu C3, C4, dále orosomukoid, alfa-2-makroglobulin, ceruloplazmin,alfa-1-antitrypsin. Mají různé funkce, fungují např. jako inhibitory proteáz nebo jako transportní proteiny. Proteiny jsou důležitou diagnostickou známkou zánětu. Nejvýraznější dynamiku má CRP. Na přítomnost zánětu reaguje v hodinách až stonásobným zvýšením koncentrace, monitorováním CRP tedy lze zachytit rozvoj zánětu, např. v pooperačním období. Nicméně jde o marker nespecifický, který se zvyšuje jak při zánětu infekčním, tak neinfekčním.

Koniec ukážky

Table of Contents

Úvod

1 Stručná fyziologie apatologie imunitního systému

1.1 Složky afunkce imunitního systému

1.2 Buněčné složky imunity

1.2.1 Buněčná imunita nespecifická

1.2.1.1 Fagocytující buňky

1.2.1.2 Buňky NK

1.2.1.3 Bazofily, žírné buňky adalší buňky

1.2.2 Buněčná imunita specifická

1.2.2.1 Lymfocyty T – pomahači

1.2.2.2 Lymfocyty T – supresorově cytotoxické buňky

1.2.2.3 Paměťové buňky

1.3 Humorální složky imunity

1.3.1 Nespecifické složky humorální

1.3.1.1 Komplementový systém

1.3.1.2 Proteiny akutní fáze

1.3.2 Specifické složky humorální

1.3.2.1 Protilátky

1.3.2.2 Autoprotilátky

1.3.2.3 Monoklonální protilátky

1.4 Komunikace mezi složkami imunity

1.4.1 Cytokiny

1.4.2 Adhezivní molekuly

1.5 HLA systém

1.6 Fyziologická imunitní reakce

1.7 Patologické imunitní reakce

1.7.1 Atopická reakce – časná přecitlivělost, I. typ

1.7.2 Cytotoxická reakce, II. typ

1.7.3 Imunokomplexová reakce, III. typ

1.7.4 Reakce oddálené přecitlivělosti, IV. typ

1.8 Nemoci zporuch imunity

1.8.1 Imunodeficience

1.8.1.1 Primární imunodeficience

1.8.1.2 Sekundární imunodeficience

1.8.2 Autoimunitní onemocnění

1.8.2.1 Systémové autoimunitní choroby

1.8.2.2 Orgánově specifické autoimunitní choroby

1.8.3 Alergie

2 Metody používané vlaboratorní diagnosticeimunopatologických stavů

2.1 Metody užívané kvyšetřování složek humorální imunity

2.1.1 Obecné principy reakce antigen–protilátka

2.1.2 Elektroforéza aimunoelektroforéza

2.1.3 Radiální imunodifuze

2.1.4 Nefelometrie aturbidimetrie

2.1.7 Imunoreakce se značenými protilátkami – RIA, ELISA, EIA

2.1.8 Imunoblotting

2.1.9 Imunofluorescence

2.2 Metody užívané kvyšetřování složek buněčné imunity

2.2.1 Techniky izolace buněk

2.2.2 Průtoková cytometrie

2.2.3 Proliferace lymfocytů (blastická transformace)

2.2.4 Enzyme-linked ImmunoSpot Assay (ELISPOT)

2.2.5 Cytotoxické testy

2.2.6 Fagocytóza

2.2.7 Baktericidní test

2.2.8 Testy oxidačního metabolizmu – NBT, INT

2.2.9 Chemiluminiscence

2.2.10 Imunohistochemické metody

2.2.11 Lektinově histochemické metody vimunologii

2.3 Metody molekulární biologie

2.3.1 PCR

2.3.2 Reverzně transkriptázová PCR

2.3.3 Kvantitativní PCR vreálném čase

2.3.5 DNA mikročipy

2.3.6 Proteomika

3 Možnosti vyšetřování složek imunity

3.1 Vyšetření parametrů humorální imunity

3.1.1 Protilátky

3.1.2 Vyšetření monoklonální komponenty

3.1.3 Kryoglobuliny

3.1.4 Vyšetření imunokomplexů

3.1.5 Proteiny akutní fáze asedimentace erytrocytů

3.1.6 Komplement ajeho složky

3.1.7 Autoprotilátky

3.2 Vyšetření parametrů buněčné imunity

3.2.1 Stanovení povrchových znaků lymfocytů adalších buněk

3.2.2 Funkční testy lymfocytů

3.2.3 Cytotoxicita buněk NK alymfocytů T

3.2.4 Stanovení cytokinů

3.2.5 Fagocytóza

3.2.6 Chemotaxe

3.2.7 Oxidační metabolizmus

3.2.8 Mikrobicidie fagocytů

3.2.9 Test aktivace bazofilů

3.2.10 Eozinofilní kationický protein (ECP)

3.2.11 Vyšetření apoptózy

3.2.12 Typizace HLA

4 Vyšetřovací algoritmy při diagnostice imunopatologických stavů

4.1 Diagnostika imunodeficiencí

4.1.1 Anamnéza

4.1.3 Spektrum indikovaných imunologických vyšetření

4.2 Diagnostika autoimunitních onemocnění

4.2.3 Spektrum indikovaných imunologických vyšetření

4.2.4 Spektrum dalších pomocných vyšetření

4.3 Diagnostika alergických onemocnění

4.3.2 Klinický obraz

4.3.3 Spektrum indikovaných imunologických vyšetření

4.4 Monitorování imunitní odpovědi při aktivní protinádorové imunoterapii

4.4.1 In vivo hodnocení antigenně specifické imunity

4.4.2 In vitro fenotypické hodnocení antigenně specifické imunitní reakce

4.4.3 In vitro funkční analýza antigenně specifické imunitní reakce

5 Systémy jakosti (kvality) vlaboratoři