Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy

Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., MUDr. Eva Tesařová a kolektiv

HEMATOLOGIE A TRANSFUZNÍ LÉkAŘSTVÍ I

HEMATOLOGIE

Vedoucí autorského kolektivu:

Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno

Autorský kolektiv:

MUDr. Jan Blatný, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno*

RNDr. Ludmila Bourková, oddělení klinické hematologie FN Brno

MUDr. Alena Buliková, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno

Mgr. Zbyněk Čech, oddělení klinické hematologie FN Brno

Mgr. Magdaléna Jelínková, oddělení klinické hematologie FN Brno*

MUDr. Jarmila Kissová, oddělení klinické hematologie FN Brno

MUDr. Zdeněk Kořístek, Ph.D., Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno

Mgr. Lucie Kovářová, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno

Doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc., Ústav experimentální biologie PřF MU

MUDr. Miloslava Matýšková, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno

MUDr. Jan Novotný, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno

Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno

Doc. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D., Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno

Bc. Markéta Slánská, oddělení klinické hematologie FN Brno*

MUDr. Petr Smejkal, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno

Bc. Irena Trnavská, oddělení klinické hematologie FN Brno

MUDr. Ondřej Zapletal, oddělení klinické hematologie FN Brno*

RNDr. Jiřina Zavřelová, oddělení klinické hematologie FN Brno

* nyní oddělení dětské hematologie FN Brno

Recenze:

Doc. RNDr. Miroslav Pecka, CSc.

Prof. MUDr. Ladislav Chrobák, CSc.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2011

Obrázky dodali autoři.

Cover Photo © fotobanka allphoto, 2011

Vydala Grada Publishing, a.s., U Průhonu 22, Praha 7

jako svou 4577. publikaci

Odpovědná redaktorka PhDr. Alena Palčová

Sazba a zlom Jana Řeháková, DiS.

Počet stran 424 + 64 stran barevných příloh

1. vydání, Praha 2011

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-3459-0

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-7192-2 pro formát PDF

ISBN 978-80-247-7193-9 pro formát EPUB

Předmluva

Publikace „Hematologie a transfuzní lékařství“ je knihou, která je specificky zaměřená na hematologickou a v hematologii používanou laboratorní diagnostiku. Je účelově zpracována především pro obec zdravotních laborantů. Publikace však může mít pochopitelně širší využití u všech odborníků, laiků, kteří mohou z textů čerpat nové nebo upřesňující poznatky potřebné pro svoji specializaci.

Původně mělo dílo zahrnovat čistě hematologickou problematiku, velmi rychle se ale rozrostlo o příbuzný (a vlastně společný atestační) obor transfuzního lékařství a následně i o problematikou, která s hematologií v laboratorní diagnostice souvisí nebo ji významně doplňuje (molekulární biologie, imunocytologie apod.).

Autorský kolektiv byl sestaven z odborníků vlastního hematologického pracoviště ve FN Brno, kteří se jednotlivými segmenty hematologického zaměření zabývají, a z důvodu co nejširšího pojetí zahrnuje lékaře, ale i další specialisty především z laboratorních oborů, včetně zdravotních laborantů.

Publikace je sestavena ze dvou dílů – samostatné hematologické a samostatné transfuziologické části, každá z nich se svou obrazovou přílohou, ale s jednotným uspořádáním, aby mohly vytvořit dvoudílný kompaktní celek.

Úvodem jsou v hematologické části zpracovány kapitoly se spíše teoretickým a obecným zaměřením, pak následují kapitoly speciální problematiky zaměřené na problémové okruhy jednotlivých systémů, jak bývají v hematologii běžně členěny, včetně tabulek normálních hodnot. Samostatnou přílohu tvoří obrázky významnějších nebo instruktivních nálezů, jejich seznam, seznam zkratek a rejstřík.

I když si jsme vědomi, že ve věku elektronického zpracování textů nemá již knižní podoba publikací svoje dominantní místo, zůstává stále pohotovým zdrojem informací. Je stále dost v oblibě u řady čtenářů, proto jsme se rozhodli ji napsat. Věříme, že své čtenáře nezklameme a přineseme jim to, co hledají a očekávají. Jsme si zároveň vědomi nutnosti inovace ve vcelku časném časovém horizontu a pokusíme se tento požadavek takového zpracování rovněž naplnit.

Čtenářům přejeme, aby jim naše práce – ať již jakkoliv – prospěla, a svým spoluautorům děkuji za úsilí a snahu přispět čtenářům ke zmíněnému prospěchu.

Miroslav Penka

Poděkování

Za pomoc při zpracování obrazové dokumentace děkujeme zdravotním laborantkám OKH FN Brno – paní Jaroslavě Hoblové, Monice Antošové, Libuši Antošové.

Autoři kapitoly 3.7 děkují Mgr. Petru Dobešovi z centra molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologické kliniky FN Brno za pomoc při technické realizaci obrázků 3.39, 3.40, 3.41, 3.42, 3.43, 3.44, 3.50, 3.51, 3.58, 3.62, 3.63, 3.64, 3.65.

Naše poděkování patří i recenzentům prof. MUDr. Ladislavu Chrobákovi, CSc., a doc. RNDr. Miroslavu Peckovi, CSc., za jejich pečlivou a precizní práci, kterou s prostudováním naší publikace měli, a za jejich kritickou shovívavost při zpracování recenze.

Poděkování patří také sponzorům, bez jejichž přispění a pomoci by publikace možná sice vznikla, ale byla by neprodejná.

Poděkování patří i všem spoluautorům, kteří se na publikaci podíleli.

1 Fyziologie krvetvorby

1.1 Vznik a vývoj krvetvorby

Krvetvorba (hemopoéza nebo hematopoéza) je v období embryonálního vývoje lokalizována nejprve do oblasti žloutkového vaku, posléze tento úkol přejímají játra a slezina a konečně pak kostní dřeň. Za patologických stavů (hemolýzy, myeloproliferativní onemocnění apod.) může dojít k opětovné aktivaci hemopoézy v játrech a slezině a dokonce i v mízních uzlinách byla popsána nelymfoidní hemopoetická aktivita (zvláště u myeloproliferací). Hemopoéza vznikající v oblasti žloutkového vaku z embryonálních kmenových buněk diferencujících se v kmenové buňky krvetvorby představuje mezoblastové období, začínající asi 14.–20. den embryonálního vývoje. Vytvářejí se ostrůvky primitivních hemopoetických buněk, lemovaných endoteliemi (area vasculosa). Asi ve 4. týdnu života se primitivní cévy žloutkového vaku propojí s cévním systémem embrya. Mezoblastové období trvá asi do 10. týdne nitroděložního života, zároveň se po 6. týdnu vývoje objevuje krvetvorba v mezenchymu mezi hepatocyty a posléze i ve slezině (hepatolienální období). Od 20. týdne nitroděložního vývoje se krvetvorba přesunuje do kostní dřeně. Hlavním hemopoetickým orgánem je kostní dřeň, je zde přítomen „pool“ (anglicky zásoba, termín se v odborném tisku o kmenových buňkách běžně používá) hemopoetických kmenových buněk – pluripotentní kmenová buňka pro všechny řady nelymfoidní i lymfoidní, kmenová buňka pro lymfoidní řadu, multipotentní kmenová buňka pro všechny nelymfoidní řady CFU-GEMM (colony forming unit – granulocytes, erythrocytes, monocytes/macrophages, megakaryocytes), zralejší kmenové buňky v podobě společných prekurzorů pro erytroidní a megakaryocytární linii a pro granulocytární/monocytární linii. Primitivní i vyzrálejší kmenové buňky podléhají tzv. asymetrickému dělení, kdy jedna z dceřiných buněk je identická s mateřskou kmenovou buňkou (self renewal – samoobnovování kmenových buněk) a druhá se dále diferencuje.

1.2 Vývoj krevních buněk

Multipotentní (totipotentní) kmenová buňka jednak v kostní dřeni udržuje relativně stálý počet těchto prekurzorů (self renewal) a na druhé straně dává vzniknout zralejším kmenovým buňkám, tzv. committed cells. Každá krvetvorná řada pak vychází z kmenových buněk pro jednotlivé linie. Eozinofilní a bazofilní řada a navíc i vývoj tkáňových bazofilů vychází ze specifických CFU (CFU-Eo, CFU-Ba a CFU-mast). Lymfoidní řada pak vychází ze společné kmenové buňky pro B a T řadu a NK cells (natural killer). Vývoj krvetvorby v časných fázích (nezralé kmenové buňky) zachycuje obrázek 1.1. Hemopoéza je pod kontrolu řady interleukinů (IL), CSF (colony-stimulating factors) a navíc zde hrají roli interakce kmenových buněk se stromatem hemopoetických orgánů – jde o tzv. hemopoetické induktivní mikroprostředí (HIM). Buněčné elementy HIM tvoří monocyty/makrofágy, endotelie, retikulární buňky aj. umístěné v extracelulární matrix. Teprve souhrou všech těchto faktorů je umožněna normální hemopoéza. Poruchy na úrovni kmenových buněk a/nebo HIM mohou vyústit v nejrůznější patologické stavy (dřeňové útlumy, myelofibrózy, myelodysplazie, akutní hemoblastózy apod.). Výzkum v oblasti kmenových buňek (a nejen hemopoetických) velmi pokročil a dotýká se jak otázek maligního bujení, tak možnosti náhrady tkání (v našem případě hematopoézy) vhodně manipulovanými kmenovými prekurzory.

Obr. 1.1 Časný vývoj krvetvorby

Na obrázku je znázorněna časná hematopoéza. Jednotlivé prekurzorové buňky nejsou identifikovatelné světelnou mikroskopií. Ze znázorněných prekurzorů se pak diferencují zralejší elementy v podobě proerytroblastů, promegakaryoblastů, myeloblastů a elementů T, B nebo nulových lymfocytů. Rovněž jsou znázorněna časná stadia diferenciace mastocytární a dendritické linie. Kmenové buňky se dělí asymetricky – v jednu identickou kmenovou buňku (self renewal) a v committed cell (buňku s další diferenciací). Tak je udržována zásoba (pool) kmenových buněk i diferenciace hematopoézy.

CFU – colony forming unit, BFU – burst forming unit, GEMM – granulocytární, erytroidní/megakaryocytární, monocytární, GM – granulocytární a monocytární, T/NK – T a NK lymfocyty, Meg – megakaryocytární

Kmenové buňky hematopoézy lze studovat řadou metod, nejpřínosnějšími jsou různé kultivační metody in vitro, kdy se využívá jednak různě komponovaných kultivačních médií, a pak i sledování odpovědi na nejrůznější růstové faktory a/nebo jejich kombinace. Každý růstový faktor se váže na specifické receptory, exprimované na povrchu různých hematopoetických prekurzorů, a tím je dána specifičnost jeho působení. Mezi růstové faktory hemopoézy patří interleukiny (IL) – IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, dále erytropoetin (EPO), trombopoetin (TPO), GM-CSF (granulocytární a makrofágové kolonie stimulující faktor), G-CSF (granulocytární kolonie stimulující faktor) c-kit ligand neboli stem cell factor (SCF) a řada dalších. Některé z růstových faktorů se již vyrábějí rekombinantní technologií (vnesením genů kódujících tyto faktory, do vhodných buněk v tkáňových kulturách) a jsou užívány léčebně (např. EPO, TPO a jeho analoga, G-CSF).

Kmenové buňky, kultivované ve vhodných médiích, se mohou dále zkoumat na ultramikroskopické úrovni, průtokovou cytometrií s eventuálním cell-sortingem (přístrojovým sběrem zvolených elementů), transfekcí do vhodných linií pokusných zvířat, sledováním aktivace různých genů detekcí specifických mRNA (messenger ribonukleových kyselin), multi-array analýzou (sledováním aktivace mnoha genů najednou) apod. Jisté struktury na povrchu (v buněčné membráně) jednotlivých řad nám mohou pomoci v detekci diferenciace těchto elementů. Jsou to nejčastěji tzv. CD znaky (clusters of differentiation). Například CD2 je znakem T lymfocytů, CD19 B lymfocytů, CD14 monocytů, CD15 granulocytů, CD16 NK buněk a glykoforin A erytroidní řady (CD235a). Pro kmenové buňky je charakteristickým znakem CD34. Více jak 99 % dřeňových elementů je CD34 negativních, avšak jen určitá část CD34 pozitivních buněk představuje nezralé kmenové buňky. O CD znacích blíže viz kapitola o flow cytometrii.

Mechanizmy vedoucí jednak k nutnému samoobnovování poolu multipotentních buněk a na druhé straně vedoucí k diferenciaci v „committed cells“ jsou jen částečně známy a jejich přesnějším poznáním by mohlo dojít k pokroku v diagnostice i léčbě např. v oblasti hemoblastóz nebo dřeňových útlumů.

V současnosti zaznamenáváme výrazný posun v poznatcích o hierarchii krvetvorby, např. se zdá, že kmenové buňky pro makrofágy a dendritické buňky lze detekovat v časných fázích lymfoidního (nemyeloidního) vývoje.

1.3 Tvorba a vývoj červených krvinek (erytropoéza)

Erytropoéza vychází ze společné linie (kmenové buňky) s megakaryopoézou a dále samostatně postupuje od BFU-E (burst forming unit-erythropoesis) přes CFU-E k již morfologicky diferencovatelným proerytroblastům. Další maturace pak probíhá přes bazofilní, polychromatofilní a oxyfilní erytroblasty k bezjaderným retikulocytům, které jsou vyplavovány z kostní dřeně do periferní krve. Jaderné erytroblasty se v periferní krvi objevují pouze za patologických stavů (vystupňovaná hemolýza, velké ztráty krve, akutní i chronické hemoblastózy, metastázy do kostní dřeně apod.). Celkově jsou erytropoéza a zralé erytrocyty označovány pojmem erytron. V erytronu je udržována dynamická rovnováha mezi zánikem a tvorbou červených krvinek. Hlavním regulačním proteinem erytronu je v ledvinách produkovaný erytropoetin (EPO). Za patologických okolností může nerovnováha v tomto systému vést k anémii nebo erytrocytóze. Nejčasnější identifikovanou buňkou erytronu je tzv. BFU-E (burst forming unit-erythroid). Tyto erytroidní prekurzory při kultivaci in vitro vytvářejí velké kolonie (proto burst = výbuch) dobře hemoglobinizovaných erytroblastů. Zpočátku je tento růst nezávislý na erytropoetinu, ale je zcela závislý na IL-3, později směsi cytokinů EPO, TPO, GM-CSF a stem cell faktoru. Detaily regulace proliferace a diferenciace BFU-E nejsou přesně známy. Morfologickyse jedná o velmi nezralé blasty, mnohdy s pseudopodickými výběžky, vysokým nukleo/cytoplazmatickým poměrem a výraznými nukleoly. BFU-E se postupně diferencují v CFU-E (colony forming unit-erythroid). Jsou to poněkud zralejší blasty, jejichž proliferace je plně závislá na EPO, a nesou na svém povrchu četné receptory pro EPO. Při pokusech na zvířatech vedla anemizace k expanzi počtu CFU-E a naopak polytransfuze k výrazné redukci CFU-E paralelně s koncentrací EPO v krvi. Proerytroblast je první identifikovatelnou buňkou pomocí světelné mikroskopie. Proerytroblast má asi 14–20 μm v průměru, jádro s relativně hrubším chromatinem (oproti myeloblastům a lymfoblastům), v cytoplazmně jsou ultramikroskopicky prokazovány známky počínající syntézy hemoglobinu, četné ribozomy a počínající struktury Golgiho komplexu. V buňkách je přítomen feritin jak difuzně, tak i v podobě organel, nazývaných siderozomy. Cytoplazma proerytroblastu je sytě bazofilní, někdy vytváří pseudopodie, někdy s projasněním u jádra (Golgiho komplex) a jádro tvoří více než 80 % plochy buňky. Bazofilní erytroblast je poněkud menší než proerytroblast (cca 12–17 μm), vykazuje zmenšující se nukleo/cytoplazmatický poměr a hrubší strukturu jádra většinou bez nukleolů. Cytoplazma zůstává sytě bazofilní, i když tato bazofilie může již být méně nápadná. S pokračující diferenciací dochází k progresivnímu zmenšování a pyknotizaci jader erytroblastů a postupné změně barvy cytoplazmy od bazofilní (sytě modrá) přes polychromatofilní (špinavě šedivá) až po růžovou při barvení podle Maye-Gruenwalda-Giemsy. Změna barvy cytoplazmy souvisí s nárůstem hemoglobinu a redukcí ribozomálních komplexů ve zrajících erytroblastech. Polychromatofilní erytroblasty jsou posledním vývojovým stupněm erytropoézy schopným dělení. Jádro je již výrazně kondenzováno a cytoplazma špinavě šedá. Velikost této buňky se pohybuje v rozmezí 12–15 μm. Ortochromní (také oxyfilní) erytroblasty již nejsou schopny dělení, jádro je silně pyknotické, malé a již v něm neprobíhá syntéza deoxyribonukleových kyselin (DNA). Oxyfilní (ortochromní) erytroblasty jsou nejmenšími elementy erytropoézy(8–12 μm), jejich velikost se téměř blíží zralým erytrocytům. Ortochromní erytroblasty však nejsou plně hemoglobinizovány, a proto jejich oxyfilie nedosahuje intenzity, jakou vidíme u zralých erytrocytů. Extruzí jádra, což je aktivní proces za účasti aktinových filament, se oxyfilní erytroblast dále vyvíjí v retikulocyty. Retikulocyty jsou poněkud větší než normální erytrocyty (normocyty) a mají nepravidelný tvar, což je zvláště dobře detekovatelné ultramikroskopicky. Retikulocyty mají zachovanou jistou možnost aktivního pohybu, což se považuje za důležité při přechodu těchto buněk přes endoteliální póry dřeňových sinusoid do periferní krve. V retikulocytech ještě probíhá syntéza hemoglobinu a některé další metabolické pochody, které nejsou prokazatelné ve zralých erytrocytech zvaných normocyty. Některými supravitálními barveními (např. brilliant kresylovou modří – blíže viz příslušná kapitola) lze ve světelné mikroskopii zobrazit v retikulocytu přítomnou ribozomální RNA jako tzv. „substantia reticulofilamentosa“. V retikulocytu však postupně dochází k degradaci RNA ribonukleázami a jinými enzymy, které jsou například blokovány při otravě olovem. RNA bloky jsou pak viditelné při normálním barvení jako bazofilní tečkování (můžeme je však vidět i u řady jiných závažných poruch krvetvorby). Normální retikulocyty vykazují asi o 20 % větší objem než normocyty. Normocyty jsou bikonkávní bezjaderné buňky, nemající vlastní proteosyntézu. Měří asi 7 μm v průměru a vykazují vysoký poměr povrch/objem, což je výhodné pro jejich hlavní funkci – přenášet do tkání kyslík. Pro normální erytropoézu jsou nezbytnou nutností aminokyseliny, železo, vitaminy B_12, B_6 a kyselina listová a některé další stopové prvky. Při těžké podvýživě (hladovění, mentální anorexie, kachexie) tak rezultuje anémie z kombinovaného deficitu uvedených látek.

Železo je biogenní prvek, který se vyskytuje prakticky ve všech živých organizmech. Najdeme je v jednobuněčných organizmech (kvasinky, bakterie), v buňkách rostlin a v tělech bezobratlých i obratlovců až po savce. Je tomu tak proto, že atom železa je schopen velmi snadno vázat i uvolňovat elektron, a tak měnit své mocenství z dvojmocné feroformy na trojmocnou feriformu a naopak. Železo se ze všech biogenních kovů vyskytuje v organizmu v nejvyšším množství, což obnáší asi 35 mg/kgu žen a 45 mg/kg u mužů. Největší podíl celkového množství železa v organizmu je obsažen v hemoglobinu (60–70 %), asi 10 % je součástí myoglobinu, cytochromů a jiných enzymů, asi 20–30 % tvoří zásobní pool v podobě vazby na feritiny, méně než 1 % je obsaženo v cirkulujícím poolu v krvi. Vedle své nejznámější funkce transportu kyslíku plní železo i řadu dalších vitálních funkcí – je nutné pro syntézu nukleových kyselin (DNA i RNA), syntézu řady proteinů, účastní se řízení buněčné proliferace a diferenciace a apoptózy, je nutné pro syntézu myelinu a formování dendritů neuronů, což se odráží v ovlivňování pochodů učení a paměti. Pozornost řady vědeckých týmů je upřena na úlohu železa v procesech stárnutí tkání, neurodegenerace, maligního bujení, aterosklerózy a role železa v imunitním systému. Železo je v krevním proudu vázáno na bílkoviny. Z největší části jde o transportní protein transferin. Molekula transferinu váže dva atomy trojmocného železa Fe+++. Denně dochází k obratu asi 25 mg železa v krvi. Za normálních okolností je transferin saturován pouze asi ze třetiny své vazebné kapacity. Při nedostatku železa saturace transferinu klesá, naopak při přetížení organizmu železem stoupá. Při rozvoji anémií chronických onemocnění dochází nejčastěji k poklesu koncentrace sérového železa i transferinu (transferin je negativní reaktant akutní fáze), takže saturace transferinu může být normální nebo mírně snížená (záleží na vzájemném poměru poklesu železa i transferinu). Molekula transferinu obsahující železo má vysokou afinitu ke specializovaným receptorům, lokalizovaným na buněčných membránách s nejhustší expresí na buňkách hemopoézy. Byly již popsány 2 typy transferinových receptorů (TfR) – TfR a TfR2.

Zásobní železo je v buňkách uloženo ve formě feritinu. U většiny obratlovců je feritin tvořen dvěma typy podjednotek, označovaných jako L (light, liver) a H (heavy, heart) feritin. Tyto podjednotky se organizují do schránek, z nichž každá je složena ze čtyřiadvaceti molekul L nebo H feritinu. Feritinové schránky jsou schopné každá pojmout několik tisíc atomů Fe+++. Jednotlivé feritiny se od sebe liší zastoupením L a H podjednotek a jsou označovány jako izoferitiny. H feritin je feroxidáza a jeho aktivita usnadňuje rychlou inkorporaci atomu Fe do feritinových komplexůa na druhé straně je toto železo rychleji z feritinu uvolňováno. Izoferitiny, bohaté na L podjednotky, přijímají Fe pomaleji a déle jej skladují. Jednotlivé tkáně a orgány se liší zastoupením exprese a translace mRNA pro L a H podjednotky feritinu. TfR a feritin představují dva hlavní proteiny regulace buněčné homeostázy železa. Při negativní bilanci železa (poruchy vstřebávání, chronické krevní ztráty, gravidita apod.) se postupně rozvíjí karence tohoto prvku. Nejprve dochází k depleci železa v zásobách monocyto-makrofágového systému (MMS), pak klesá saturace transferinu pod 15 % jeho celkové vazebné kapacity a současně stoupá i koncentrace transferinu v krvi. Po vyčerpání zásob železa v MMS i snížení jeho obsahu v krvi se rozvíjí hypochromní mikrocytární anémie, kterou je však nutno odlišit hlavně od anémií chronických onemocnění, hemoglobinopatií a myelodysplastických syndromů, což nebývá ve většině případu příliš obtížné, ale občas bývá diferenciální diagnostika svízelná. Při nedostatku pyridoxinu dochází k poruše syntézy hemu s obrazem mírné hypochromní anémie. Rovněž vzácný nedostatek mědi má také za následek vadnou syntézu hemu s hypochromií. Při nedostatku vitaminu B_12 a/nebo kyseliny listové vídáváme obraz makrocytární až megaloblastické anémie, v diferenciální diagnostice těchto stavů nutno především odlišit myelodysplastické syndromy. Makrocytární anémie u chronických onemocnění jater nemívá většinou patrnou výraznější ovalocytózu, která naopak přichází u MDS a perniciózní anémie (vše podrobněji v kapitole zabývající se chudokrevností).

1.4 Hemoglobin

Krevní barvivo hemoglobin tvoří více než 90 % váhy normocytu a aktivace globinových genů je pozorována již na úrovni časné BFU-E. Hemoglobin je utvářen dvěma páry globinových řetězců (tetramer), čtyřmi tetrapyrolovými prstenci v podobě protoporfyrinu IX a čtyřmi centrálně uloženými atomy dvojmocného železa. Atom železa je vázán ve středu každého tetrapyrolového kruhu (obr. 1.2). Protoporfyrin s centrálně umístěným atomem železa nazýváme hem. Globin je tvořen dvěma páry řetězců – asi 97 % představuje tetrametr α2β2 (HbA_1), maximálně 3,2 % představuje tetrametr α2δ2 (HbA_2) a pouze stopy připadají na HbF (β2γ2) – fetální hemoglobin. Struktura hemoglobinu se mění během embryonálního, fetálního a postnatálního života. Embryonální a fetální hemoglobiny vykazují vyšší aktivitu ke kyslíku než adultní hemoglobiny (snadnější přebírání kyslíku z mateřské krve). Geny pro globinové řetězce jsou lokalizovány na chromozomech 16 (tzv. α-like cluster) a 11 (β-like cluster). Podrobnější popis překračuje rámec této učebnice, lze jen shrnout, že v dospělosti jsou aktivní β, α a δ geny a že poruchy v aktivaci jednotlivých genů (poruchy struktury genů, poruchy transkripce a/nebo translace) vídáváme u talasemií a méně často u myeloproliferací a myelodysplazií. Talasemie se endemicky vyskytují v oblastech kolem Středozemního moře a v jihovýchodní Asii. U bílé rasy jde nejčastějio β talasemii s poruchami syntézy β řetězců. V erytrocytech klesá koncentrace HbA_1 a zvyšuje se hladina HbA_2 a HbF. Podle stupně postižení hovoříme o talasemii minima, minor a maior. Společným znakem talasemií je pokles koncentrace hemoglobinu, hypochromie a nápadně snížený střední objem červených krvinek, v krevním nátěru lze nalézt různý počet terčovitých erytrocytů (tzv. target cells). V diferenciální diagnóze je nutno vyloučit především anémie z nedostatku železa a v endemických oblastech i jiné hemoglobinopatie (HbS, HbE, HbC, HbD aj.). Striktně vzato nepatří talasemie mezi klasické hemoglobinopatie, jelikož jde většinou o kvantitativní (snížení syntézy) a ne kvalitativní poruchu (patologické hemoglobiny s odlišnou strukturou). Nejčastějšími hemoglobinopatiemi v užším smyslu slova jsou hemoglobiny S, C, D a E (blíže v kapitole věnované anémiím).

Syntéza tetrapyrolového kruhu začíná aktivací genu pro δ aminolevulonátsyntázu (ALAS). Z δ aminolevulonové kyseliny a porfobilinogenu je syntetizován uroporfyrinogen – izomery I a III – jde již o tetrapyrolový kruh. Přes koproporfyrinogen III a protoporfyrinogen III je syntetizován finální produkt – protoporfyrin IX.Enzym hemsyntetáza pak inkorporuje do protoporfyrinu IX atom dvojmocného železa a vzniká tak hem. Hem se mimo své hlavní funkce přenašeče kyslíku v hemoglobinu vyskytuje např. i v cytochromech, peroxidázách a myoglobinu. Hem plní i regulační funkce – stimuluje syntézu globinových řetězců i jiných proteinů. Při poklesu lokální koncentrace hemu dochází k útlumu syntézy těchto bílkovin. Při vrozených a/nebo získaných poruchách funkce enzymů syntetizujících jednotlivé porfyriny vznikají tzv. porfyrie.

Obr. 1.2 Schéma molekuly hemoglobinu

Hemoglobin se skládá ze dvou párů globinových řetězců, čtyř cyklických protoporfyrinů IX a čtyř atomů dvojmocného železa, umístěných v centru každého protoporfyrinu. Více než 97,5 % hemoglobinu dospělých představuje hemoglobin HbA_1, skádající se ze dvou řetězců α a ze dvou řetězců β (α2β2). Za normálních okolností dosahuje minoritní hemoglobin A_2 (α2δ2) maximálně 3,3 % celkového cirkulujícího hemoglobinu. Při poruše syntézy β řetězců (β talasemie) se zvyšuje podíl HbA_2 a HbF (α2γ2) v cirkulaci.

1.5 Tvorba a vývoj bílých krvinek

Granulopoéza a monocytopoéza vycházejí ze společné kmenové buňky CFU-GM, ze které se pak diferencují kmenové buňky pro granulopoézu (CFU-G) a monodendritický prekurzor s další diferenciací v monocyto-makrofágovou linii (CFU-M) a dendritický prekurzor (obr. 1.1). Pomocí morfologických, cytochemických, ultrastrukturálních a imunologických metod můžeme odlišit myeloblasty od monoblastů. Myeloblasty se dále diferencují v promyelocyty, nezralé a zralé myelocyty, metamyelocyty, tyčky a segmentované neutrofily. Monoblasty se diferencují v promonocyty a zralé monocyty/makrofágy.

Morfologicky lze v kostní dřeni identifikovat prekurzorové buňky bílé řady až ve stadiu myeloblastů. Jedná se o cca 10–18 μm velké nezralé elementy s vysokým nukleo/cytoplazmatickým poměrem s jemným jaderným chromatinem s 2–5 prominujícími nukleoly. Jádro myeloblastu má zpravidla jemnější strukturu než jádro proerytroblastu a cytoplazma je méně bazofilní. Jádro se jeví síťovitě nebo vláknitě uspořádané, někdy má chromatin podobu jemných krupiček a je uloženo centrálně. V cytoplazmě myeloblastů mohou být detekována nečetná primární (azurofilní) granula, která vykazují pozitivní reakci na myeloperoxidázu, někteří autoři však blasty s nečetnými primárními granulami řadí již k promyelocytům. V případě leukemických myeloblastů většina autorit granula připouští (leukemické blasty I–III) (blíže v kapitole o leukemiích).

Dalším vývojovým stadiem myelopoézy jsou promyelocyty. Tyto buňky jsou nápadné svou velikostí (12–20 μm), mají zpravidla excentricky uložené jádro s hrubší strukturou chromatinu než myeloblasty s většinou dobře patrnými nukleoly. Jádro často vykazuje lehké vyhloubení jaderné membrány, ve kterém je patrné zřetelné projasnění cytoplazmy. Ultramikroskopicky je v této lokalizaci detekován tzv. Golgiho komplex (slouží ke třídění a „balení“ v buňce syntetizovaných makromolekul do granul). Cytoplazma promyelocytů si zachovává bazofilní barvení a jsou v ní patrná četná primární granula. Tato primární granula jsou syntetizována v promyelocytech a myelocyty je již netvoří, jsou však detekovatelná ve všech vývojových stadiích granulopoézy, včetně nejzralejších segmentů. Primární granula jsou velká asi 500 nm, jejich membrána nese četné antigenní struktury (CD63, CD66c, CD68) a obsahují myeloperoxidázu, lysozym, elastázu, defenziny a mnoho dalších látek, hrajících roli v obraně organizmu proti infekci a v remodelaci tkání. Primární granula se již dále nevyvíjejí, jen perzistují. V promyelocytech nejsou přítomna sekundární granula.

Myelocyty se vyznačují poklesem nukleo/cytoplazmatického poměru, hrubší strukturou chromatinu a zvyšujícím se počtem sekundární granulace (neutrofilní, eozinofilní a bazofilní – v závislosti na diferenciaci). Sekundární granula jsou menší než primární, mají průměr cca 200 nm a jsou negativní na myeloperoxidázu. Na povrchu nesou četné struktury jako CD15, CD66a, CD66b a mnoho dalších, obsahují kolagenázu, lysozym, histaminázu, heparinázu, vitamin B_12 vázající protein, aktivátor plazminogenu, laktoferin aj. Sekundární granula jsou na hranici viditelnosti světelným mikroskopem. Cytoplazma neutrofilních myelocytů pozbývá bazofilního zabarvení ve prospěch eozinofilního (růžového) odstínu. Ve zralejších elementech myeloidní řady se navíc popisují i terciální granula, rovněž obsahující různé proteiny, především želatinázu a lysozym.

Lze detekovat nezralé a zralé myelocyty. V nezralých myelocytech vidíme bazofilnější zabarvení cytoplazmy, jemnější strukturu jádra a vzácně mohou být patrné i nukleoly. Nukleoly jsou dobře patrné ultramikroskopicky. Myelocyty představují nejzralejší myeloidní elementy, které mají ještě schopnost buněčného dělení. Velikost těchto buněk se pohybuje mezi 12–18 μm.

Metamyelocyty jsou poněkud menší než myelocyty (10–18 μm), mají menší a hutnější jádro, které většinou vykazuje ledvinovitý tvar. Tyto buňky se za fyziologických okolností, stejně jako jejich dříve zmíněné prekurzory, vyskytují jen v kostní dřeni, nikoli v periferní krvi. Za normálních okolností se v periferní krvi vyskytují pouze tyče a segmenty. Rozdíl mezi tyčemi a segmenty se kupodivu v literatuře uvádí různě jako poměr tloušťky mezi nejtenčím a nejširším místem jádra – různí autoři hovoří o jedné třetině nebo polovině, jiní dokonce za segmenty považují až elementy s vlákénkovitým (jako nit tenkým) spojením mezi částmi jádra.

Zralé tyče a segmenty jsou uvolňovány do periferní krve. Přesný mechanizmus regulace tohoto procesu není znám. Poločas zralých elementů v periferní krvi obnáší asi 6 hodin. Zralé neutrofily jsou atrahovány do míst infekce a/nebo poškození tkání, kde dochází k interakci s endoteliemi s následným vycestováním do tkání na bázi chemotaxe.

Osud zralých neutrofilních leukocytů u zdravých lidí bez infekce nebo poranění není zcela jasný, zdá se, že část je eliminována přestupem sliznice gastrointestinálního traktu.

Eozinofilní řada, bazofilní řada a mastocyty vycházejí ze společného prekurzoru, pozitivního na CD34 znak a dosud nenesoucího specifické receptory pro IgE (Fc epsilon R). Tento prekurzor se pak diferencuje v již odlišené kmenové buňky pro mastocyty (CFU-Mast) a pro Eo/Bazo řadu. Kmenová buňka pro mastocytární řadu má na buněčné membráně na rozdíl od společné kmenové buňky pro eozinofilní/bazofilní řadu receptor pro SCF (stem cell factor) – c-kit. Společná kmenová buňka pro eozinofilní/bazofilní řady vyzrává přes stadia pre-Ba/Eo, common Ba/Eo v již oddělené prekurzory CFU-Eo a CFU-Bazo.

Eozinofilní řada pak již vychází ze specifické kmenové buňky CFU-Eo, dále se diferencující ve zralejší blasty a dále v eozinofilní promyelocyty, metamyelocyty, tyče a segmenty. K této diferenciaci je zapotřebí IL-3, IL-5 a GM-CSF. Sekundární eozinofilní granula vykazují specifickou strukturu v elektronové mikroskopii a obsahují řadu prozánětlivých cytokinů, bazický protein, kationický protein, neurotoxin a eozinofilní myeloperoxidázu.

Bazofilní granulocyty se diferencují z kmenové buňky CFU-bazo v bazofilní myeloblasty, promyelocyty, metamyelocyty a zralé segmenty. Bazofily se liší od mastocytů v řadě parametrů. Ve světelné mikroskopii je nejnápadnějším rozdílem vzhled jádra a počet a velikost bazofilních granul. Jádro bazofilu je na rozdíl od mastocytu laločnaté, granula mastocytu jsou většinou větší, ale vždy velmi početná, zakrývající jádro. V elektronové mikroskopii jsou tyto rozdíly jasně patrné. Bazofily a mastocyty se liší i obsahem specifických granul a expresí znaků na buněčné membráně. Obě řady obsahují histamin, chondroitin sulfát a destičky aktivující faktor (PAF), mastocyty navíc i heparin a daleko více mediátorů zánětu. V řízení proliferace a diferenciace mastocytů hraje hlavní roli SCF (stem cell factor nebo c-kit ligand), zatímco v bazofilní řadě IL-3, IL-5, GM-CSF a TGFβ (transforming growth factor β).

Monocyto-makrofágová řada se diferencuje ze společného prekurzoru s granulopoézou (CFU-GM). CFU-GM vyzrává v CFU-G a monodendritický prekurzor. CFU-G dává vzniknout granulopoéze a monodendritický prekurzor se dále diferencuje ve dvě větve: nezralé elementy dendritické řady a monoblasty. Monoblasty lze ve světelné i elektronové mikroskopii jen velmi obtížně odlišit od myeloblastů. Monoblasty mohou být různě výrazně pozitivní na nespecifickou esterázu se zřetelným blokem reakce natrium fluoridem (NaF), myeloperoxidázová reakce v nich bývá zpravidla negativní nebo jen lehce pozitivní. Téměř specifická pro myeloidní řadu je reakce na chloroacetátesterázu, naproti tomu pro monocytární řadu je téměř specifická reakce na butyrátesterázu s následným blokem NaF.

Zralejší promonocyty již více připomínají monocytární elementy, mají většinou ledvinovité jádro s retikulárním chromatinem, kde ještě můžeme nacházet různě zřetelné nukleoly. Cytoplazma je bazofilní, ale již může pomalu nabývat typické kouřovité zabarvení. Zralé monocyty mají nepravidelné (většinou ledvinovité) jádro bez nukleolů a cytoplazma je kouřově šedá s jemnou (poprašek) azurofilní granulací. Monocyty vycestovávají do tkání, kde je označujeme jako makrofágy. Makrofágy jsou přítomny prakticky ve všech tkáních a orgánech, v některých mohou plnit specifické funkce (např. osteoklasty v kostní tkáni, mikroglie v mozku, Kupfferovy buňky v játrech, Langerhansovy buňky v kůži). Základními funkcemi monocyto-makrofágového systému jsou fagocytóza mikroorganizmů, eliminace a prezentace antigenů, výrazná účast na remodelaci tkání, destrukce starých nebo poškozených erytrocytů s nemalým podílem na ovlivnění metabolizmu železa. S buňkami monocyto-makrofágového systému funkčně i vývojově spřízněné dendritické buňky detekujeme v primárních i sekundárních lymfatických orgánech (viz níže) a sliznicích, kde je nacházíme jako epiteliální, folikulární nebo interdigitující elementy. Dendritické buňky nesou na svém povrchu početné antigeny hlavního histokompatibilního komplexu (MHC – main histocompatibility complex) a prezentují v tomto kontextu cílové antigeny T lymfocytům.T lymfocyty mohou být následkem této interakce aktivovány. Při těchto pochodech je rovněž uvolňována jak lymfocyty, tak i dendritickými buňkami řada mediátorů. Prezentace antigenů se účastní i buňky monocyto-makrofágového systému.

Lymfocytární řada prodělává vzhledem ke svým zásadním regulačním funkcím v imunitních pochodech dosti složitý vývoj. Po diferenciaci ze společné multi (toti)-potentní buňky pro nelymfoidní i lymfoidní řadu se lymfoidní kmenové buňky dále diferencují do T řady nebo B řady.

Lymfoblasty jsou zpravidla poněkud menší než myeloblasty s úzkým lemem cytoplazmy kolem kulatého jádra s hutnějším chromatinem a zpravidla obsahují jen 1–2 nukleoly. Lymfoblasty jsou peroxidáza negativní. V jádrech nezralých prekurzorů lymfatické řady lze detekovat enzym terminální deoxynukleotidyl transferázu (TdT), který je pozitivní u cca 90 % akutních lymfoblastických leukemií a jen vzácně u akutních myeloidních leukemií. Prolymfocyty jsou menší než lymfoblasty s hutnějším jádrem a většinou dobře patrným centrálním nukleolem. Zralé lymfocyty se vyznačují velkou morfologickou i funkční variabilitou a plasticitou. Pro vývoj lymfocytů jsou zásadními primární a sekundární lymfatické orgány. Primárními lymfatickými orgány jsou kostní dřeň a thymus. Lymfocyty se zde diferencují v B a T lymfocyty. Diferenciace T lymfocytů probíhá v tymu. Tymus se skládá z lalůčků (lobulů), kde diferencující se lymfocyty přicházejí do kontaktu s epiteloidními a interdigitujícími dendritickými buňkami a makrofágy, které jak přímým kontaktem, tak produkcí řady cytokinů indukují vyzrávání ve zralé T helper (CD4+) nebo T supressor (CD8+) lymfocyty. T i B lymfocyty, které opouštějí primární lymfatické orgány a dosud se nesetkaly s cílovými antigeny, označujeme jako naivní. Po setkání s cílovými antigeny (může jít o infekční agens, tumory nebo i tělu vlastní nepatologické antigeny v případě autoimunitních onemocnění) se lymfocyty stávají „paměťovými buňkami“ – memory cells nebo efektorovými lymfocyty v podobě plazmatických buněk (B lymfocyty) nebo cytotoxických T lymfocytů. Memory cells při opětovném setkání s antigeny vytvářejí klony, které rychle reagují tvorbou protilátek (B lymfocyty) nebo buňkami zprostředkovanou imunitní reakcí (T lymfocyty). Tvorbou a uvolňováním řady stimulačních i inhibičních cytokinů je pak ovlivněna i reakce ostatních složek imunitní odpovědi (granulocytů, monocytů/makrofágů, žírných buněk, retikulárních buněk). Lymfocyty tak představují centrální buňky v procesech i regulaci imunitní odpovědi a hovoříme zde o specifické celulární i humorální imunitě, na rozdíl od nespecifické imunity, představované komplementem a ostatními nelymfoidními buňkami.

Sekundárními lymfatickými orgány jsou lymfatické uzliny a slezina. Lymfatické uzliny mají aferentní a eferentní lymfatické cévy, přes které protéká lymfa s lymfocyty. Uzliny obsahují lymfatické folikuly, tvořené převážně B lymfocyty. V centru folikulů proliferují morfologicky „nezralé“ centroblasty, diferencující se ve zralé centrocyty. Centroblasty jsou různě veliké, mají zpravidla „naštěpené“ jádro. Velikost, nukleo/cy-toplazmatický poměr a bazofilie cytoplazmy závisí na antigenní stimulaci v regionální lymfatické uzlině. Ve folikulech je přítomna i jistá populace T lymfocytů, které se účastní modulace imunitní odpovědi i pochodů celulární imunity. T lymfocyty jsou přítomny hlavně v plášťové (mantle) zóně lymfatických folikulů. Výrazně proliferující morfologicky „nezralé“ lymfocyty jsou někdy označovány jako imunoblasty (B i T). Tyto buňky jsou zvláště při virových infekcích (nejmarkantněji při infekční mononukleóze) vyplavovány do periferní krve, kde jsou detekovány jako morfologicky velmi heterogenní populace, souhrně některými autory označovaná jako „virocyty“ (také nepřesně jako lymfomonocyty, přesněji aktivované lymfocyty).

V regionálních lymfatických uzlinách a v lymfatických folikulech ve silznicích makrofágy a dendritické buňky prezentují cílové antigeny naivním i paměťovým lymfocytům, které pak recirkulují a znovu se mohou usazovat v místech antigenní stimulace (homing). Lymfatické folikuly ve sliznicích gastrointestinálního traktu nazýváme Peyerovy plaky. Postavení sleziny v řízení diferenciace lymfatické řady a v řízení specifické imunitní odpovědi není zcela jasné, představuje vzhledem ke své velikosti a struktuře značný rezervoár T i B lymfocytů. U splenektomovaných (zvláště pro úraz a ne pro hematologická onemocnění) však nejsou výše uvedené procesy proliferace a diferenciace lymfocytů výrazněji narušeny.

Proliferaci a diferenciaci B lymfocytů lze rozdělit na antigenu nezávislé a závislé období. Prvé období probíhá v kostní dřeni, kdy ze z kmenových buněk postupně diferencuje nezralý pro-B element, CD34+ a CD19+. Další fází je pre-B buňka, která se dále diferencuje ve zralý naivní B lymfocyt. Nevelká populace těchto lymfocytů nese společné znaky pro T (CD5) a B řadu (CD19). U typické chronické lymfatické leukemie je většina leukemických lymfocytů CD5+CD19+. Naivní lymfocyty po setkání s cílovými antigeny buď podléhají apoptóze (negativní selekce, eliminují se tak zvláště autoreaktivní klony), nebo se diferencují v plazmocyty, tvořící protilátky proti cílovému antigenu. Další možností je diferenciace v paměťové buňky, které recirkulují. Při dalším setkání s příslušnými antigeny jsou rychleji produkovány klony plazmocytů produkující protilátky. V této řadě lze rozlišit plazmablast, proplazmocyt a zralý plazmocyt.

Velmi zajímavou a důležitou kapitolou je postupná aktivace genů pro imunoglobuliny v B prekurzorech. Široký repertoár specifických imunoglobulinů je syntetizován jednotlivými klony B lymfocytů. Každý klon je zodpovědný za tvorbu protilátky, zaměřené pouze proti určitému antigenu nebo antigenní determinantě. Protilátky jsou tvořeny dvěma páry těžkých a dvěma páry lehkých řetězců, podle struktury těžkého řetězce pak rozeznáváme 5 tříd imunoglobulinů: IgM, IgG, IgD, IgE a IgA. Specifita a jedinečnost každé protilátky je zajištěna specifickou strukturou (hyper)variabilní části molekuly, která pak rozeznává antigen na principu jedinečnosti klíče a zámku. Variabilní části molekul imunoglobulinů jsou kódovány variabilními úseky genů, které vykazují (hyper)mutace. V časném stadiu vývoje B lymfocytu lze molekulárně biologickými metodami detekovat nejprve aktivaci – přestavbu (gene rearrangement) genu pro těžké řětězce μ, následovanou přestavbou genů pro lehké řetězce κ a λ. Posléze dochází i k aktivaci genů pro těžké řetězce δ, α, ε a γ. Prvními molekulami v cytoplazmě B buněk jsou tak imunoglobuliny IgM, které jsou pak exprimovány na cytoplazmatické membráně jako receptory pro antigeny. IgM jsou na povrchu B buněk postupně vystřídány molekulami IgD. V jednotlivých klonech B lymfocytů jsou v závislosti na aktivaci příslušného genu pro těžké řetězce syntetizovány imunoglobuliny IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. V úsecích genů, které kódují hypervariabilní oblasti protilátek (úseky, rozeznávající antigeny), dochází k „hypermutacím“. Vzniká tak široký rejstřík buněčných receptorů a protilátek. Klony těchto B buněk (již zmíněné centroblasty) se diferencují v centrocyty, které podléhají apoptóze (negativní selekce autoreaktivních klonů), nebo se diferencují v plazmocyty nebo paměťové buňky. Jak již bylo řečeno, tyto procesy jsou ovlivňovány antigen prezentujícími dendritickými buňkami a T lymfocyty.

Vývoj zralých T lymfocytů probíhá (viz výše) v tymu. Podobně jako u imunoglobulinů je struktura buněčných receptorů T lymfocytů (TCR – T-cell receptor) polymorfní a jedinečná pro každý vyvíjející se T klon. Rozeznáváme dva typy TCR: TCR z řetězců α a β a TCR z řetězců γ a δ. Nezralé tymocyty exprimují na svém povrchu CD34, postupně pak CD2, CD5, CD7 a v cytoplazmě CD3. Z hlediska funkce tymocytů jsou důležité antigeny CD4 a CD8. Nejméně zralé buňky jsou CD4- CD8-, pak následují lymfocyty CD4+ CD8+ (double positive) a konečně CD4+ nebo CD8+.

Přestavba s následnou aktivací genů pro TCR (gene rearrangement) začíná v genu pro β řetězec TCR. Následně se diferencují již zmíněné CD4+ CD8+ buňky. Dalším krokem je rearrangement v genu pro α řetězec s kompletizací TCR α/β. Menšina tymocytů aktivuje geny γ a δ a kompletuje tak TCR γ/δ. Tyto lymfocyty jsou morfologicky patrné jako velké granulární lymfocyty a tvoří tak část populace LGL (large granular lymphocytes). Naivní zralé T lymfocyty pak ve spolupráci s dendritickými buňkami podléhají negativní a pozitivní selekci, kdy autoreaktivní a nereaktivní lymfocyty jsou eliminovány indukcí apoptózy (programovaná buněčná smrt) a na cizí antigeny přiměřeně reagující klony jsou uvolňovány z tymu do cirkulace. Zralé T lymfocyty jsou cca 5–8 μm velké buňky s malým lemem cytoplazmy kolem hutně vyhlížejícího jádra s malým počtem organel v světle modré cytoplazmě.

CD4+ a TCR α/β nesoucí T lymfocyty jsou induktory a regulátory specifické imunitní odpovědi (T helper cells). Diferencují se v Th1 a Th2 buňky, lišící se spektrem produkce cytokinů. Th1 lymfocyty indukují reakce cytotoxických T a NK lymfocytů a zvyšují potenci monocyto-makrofágového systému, zatímco Th2 buňky aktivují protilátky produkující B lymfocyty.

CD8+ a TCR α/β buňky představují primárně cytotoxické T lymfocyty. Tyto buňky po stimulaci antigenem (prezentace dendritickými buňkami – první signál) exprimují receptor pro IL-2. Jako druhý signál k proliferaci cytotoxického T klonu slouží navázání IL-2 na tento receptor. IL-2 je sekretován aktivovanými Th1 lymfocyty. Aktivované cytotoxické CD8+ lymfocyty potom indukují apoptózu cílové antigeny nesoucích buněk poškozením membrány i jádra těchto elementů.

Nulové lymfocyty (null-cells) se vyvíjejí nejspíše ze společných kmenových buněk s klasickými T lymfocyty (T/NK prekurzory), nenesou však na svém povrchu většinu znaků pro B a T řadu. Jde o funkčně i fenotypicky heterologní populaci lymfocytů, které ve světelném mikroskopu označujeme jako velké granulární lymfocyty (LGL – large granular lymphocytes). Jedná se o velké buňky (10–12 μm) s vysokým podílem bledě modré cytoplazmy s azurofilními granulami, které jsou peroxidáza negativní. LGL mohou být zastoupeny v periferní krvi asi v 10–15 % z lymfocytární řady. Část LGL je pozitivní na CD56 a negativní pro CD8 a TCR. Tyto elementy jsou skutečnými přirozenými zabíječi (NK cells, nature killer), které mohou být cytotoxické bez předchozí aktivace antigenem. Populace CD56-CD57+CD8+TCR α/β+ se označuje jako NK-like cells. Nulové buňky jsou angažovány v regulaci hematopoézy, obraně proti infekcím a imunitním dozoru proti nádorům. Část populace LGL tvoří TCR γ/δ pozitivní lymfocyty (viz výše).

Pomocí molekulárně genetických metod, detekujících přestavbu genů pro imunoglobuliny v B lymfocytech (a analogicky genů pro T buněčné receptory v T lymfocytech) lze lépe diagnostikovat časné prekurzory jednotlivých řad u akutních lymfoblastických leukemií.

Koniec ukážky

Table of Contents

Tiráž

Předmluva

Poděkování

1 Fyziologie krvetvorby

1.1 Vznik a vývoj krvetvorby

1.2 Vývoj krevních buněk

1.3 Tvorba a vývoj červených krvinek (erytropoéza)

1.4 Hemoglobin

1.5 Tvorba a vývoj bílých krvinek

1.6 Tvorba a vývoj trombocytů

1.7 Hodnocení

1.8 Klinický význam

2 Fyziologie krevního srážení

2.1 Cévy, cévní systém

2.3 Systém plazmatických faktorů

2.3.1 Systém koagulačních faktorů

2.3.1.1 Koagulační faktory

Proenzymy – enzymy

Kofaktory

2.3.2 Systém přirozených inhibitorů

2.3.3 Fibrinolytický systém

3 Laboratorní diagnostika v hematologiii

3.1 Morfologická vyšetření

3.1.1 Hematologické analyzátory

3.1.2 Vyšetření na hematologických analyzátorech

3.1.2.4 Stanovení počtu retikulocytů

3.1.3 Morfologická charekteristika hematopoetických buněk

3.1.3.1 Erytrocytární vývojová řada

Normoblastová vývojová řada

Megaloblastová vývojová řada

3.1.3.2 Leukocytární vývojová řada

Granulocyty

Monocyty

Lymfocyty

Plazmatická buňka

3.1.3.3 Megakaryocytární vývojová řada

3.1.4 Nátěry periferní krve a kostní dřeně

3.1.4.3 Hodnocení nátěrů periferní krve

Hodnocení leukocytů

Hodnocení trombocytů

Hodnocení erytrocytů

3.2 Základní vyšetření pro hemolytické anémie

3.2.1 Obecné testy

3.2.2 Testy na průkaz abnormálních hemoglobinů

3.2.3 Testy na průkaz nedostatku enzymů

3.2.3.1 Barvení Heinzových tělísek

3.3 Cytochemická vyšetření

3.5 Hemokoagulační laboratorní vyšetření

3.5.1 „Bed-side“ testy

3.5.2 Primární hemostáza

3.5.3 Systém plazmatických koagulačních faktorů

3.5.4 Přirozené inhibitory

3.5.5 Testy fibrinolytického systému

3.5.6 Identifikace získaného inhibitoru

3.5.6.4 Identifikace lupus antikoagulans (podle doporučení SSC ISTH)

3.5.7 Molekulární markery

3.5.8 Diagnostika von Willebrandovy choroby

3.5.8.2 Vyšetření funkční aktivity VWF

3.5.8.3 Diskriminační testy

3.5.9 Diagnostika HIT

3.5.10 Sledování léčby

3.6 Flowcytometrické vyšetření

3.6.4 Příklady uplatnění v hematologii

3.6.4.1 Neonkologické indikace

3.7 Cytogenetické a molekulárně genetické vyšetření

3.7.3 Cytogenetické vyšetření

3.7.4 Molekulárně biologické metody

3.7.4.1 Separace buněk, izolace nukleových kyselin

3.7.4.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Aplikace PCR v hematoonkologické diagnostice

Aplikace PCR v neonkologické hematologii

3.7.4.3 Metody detekce mutací

3.7.4.4 Metody analýzy proteinů

3.7.4.5 Genomika a proteomika

4 Fyziologické hodnoty krevního obrazu a koagulačních testů

5 Neonkologická hematologie

5.1 Anémie (chudokrevnost)

5.1.1 Anémie z poruchy tvorby erytrocytů

5.1.1.1 Anémie z poruchy syntézy hemoglobinu

Sideroblastické anémie

Anémie z poruchy syntézy globinu – talasemie

5.1.1.2. Anémie z poruchy syntézy DNA – megaloblastové anémie

5.1.1.3 Anémie ze selhání hemopoetických buněk – aplastické anémie

Vrozené aplastické anémie

Získané aplastické anémie

5.1.1.4 Anémie spojené s poruchou vyzrávání krvetvorby – dysplastické (dyserytropoetické) anémie

Kongenitální dyserytropoetické anémie (KDA)

5.1.2 Anémie ze zvýšené ztráty erytrocytů

5.1.2.1 Korpuskulární hemolytické anémie

Hemolytické stavy s poruchou membrány erytrocytů

Hemolytické stavy s poruchou metabolizmu erytrocytů

Hemoglobinopatie

5.1.2.2 Extrakorpuskulární hemolytické anémie

Neimunitní hemolytické anémie

5.2 Poruchy leukocytárního systému

5.2.1 Kvantitativní poruchy leukocytárního systému

5.2.1.1 Změny počtu jednotlivých typů bílých krvinek

5.2.1.2 Choroby monocytárního makrofágového systému

Systémová forma LCG

Lokalizované formy

Non-LCG granulomatózy

Střádací choroby (tezaurismózy)

5.2.2 Kvalitativní poruchy leukocytárního systému

5.2.2.1 Morfologické změny leukocytů

Vrozené morfologické anomálie

Získané morfologické anomálie

5.2.2.2 Funkční změny leukocytů

Vrozené poruchy granulocytárních funkcí

5.3 Poruchy primární hemostázy –poruchy krevního srážení z destičkových příčin

5.3.1 Kvantitativní poruchy primární hemostázy

5.3.1.1 Trombocytopenie

Imunitně podmíněné trombocytopenie

5.3.2 Kvalitativní poruchy primární hemostázy – trombocytopatie

5.3.2.1 Vrozené trombocytopatie

Porucha adhezivity

Porucha agregability

Poruchy sekrece destiček

5.4 Vrozené krvácivé stavy

5.5 Trombofilie

5.6 Získané poruchy krevního srážení

5.6.1 Získané poruchy krevního srážení bez přítomnosti inhibitoru

5.6.2 Získané poruchy krevního srážení z poruchy plazmatických faktorů vznikající na imunitním podkladě

5.6.2.1 Choroby provázené přítomností specifických autoprotilátkek/inhibitorů

Protilátky proti prokoagulačním faktorům krevního srážení

5.6.2.2 Nespecificky působící antikoagulancia

5.7 Sledování antitrombotické léčby

6 Onkologická hematologie

6.1 Akutní leukemie

6.1.1 Akutní myeloidní leukemie (AML)

6.1.1.1 Akutní myeloidní leukemie s rekurentní genetickou abnormitou (nejčastěji s balancovanou translokací či inverzí)

6.1.1.4 Akutní myeloidní leukemie jinak neurčené

6.1.3 Akutní lymfoblastické leukemie, respektive prekurzorové lymfoblastické neoplazie

6.2 Myelodysplastický syndrom (MDS)

6.3 Myeloproliferativní neoplazie a myelodysplasticko/myeloproliferativní neoplazie

6.3.1 Myeloproliferativní neoplazie (MPN)

6.3.1.7 Mastocytóza

6.3.2 Myeloidní a lymfoidní neoplazie s eozinofilií a abnormalitami PDGFRA (platelet derived growth factor receptor α), PDGFRB (platelet derived growth factor receptor β) nebo FGFR1 (fibroblast growth factor receptor-1)

6.3.3 Myelodysplasticko/myeloproliferativní neoplazie (MDS/MPN)

6.4 Lymfoproliferativní onemocnění

6.4.1 Neoplazie ze zralých B buněk

6.4.1.6 Malignity z plazmatických buněk

6.4.2 Malignity ze zralých T a NK buněk

6.4.3 Hodgkinovy lymfomy (HL)

6.5 Hematologické malignity u dětí

6.6 Onkologická hematologie: transplantace hematopoetických buněk